SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合基序的来源可能

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关联组

SARS-CoV-2的S蛋白中的关键部分的人工改造的痕迹

条件组

SARS-CoV-2的刺突(Spike)蛋白

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假设SARS-CoV-2的RBM来源于自然的两种可能

SARS-CoV-2 RBM与SARS-CoV RBM 相似的方式以及SARS-CoV-2 与ZC45/ZXC21 之间的整体序列保留模式是非常不寻常的。综上所述,这表明SARS-CoV-2 基因组的一部分并非来自天然的准物种病毒粒子进化过程。


如果SARS-CoV-2 确实来自自然进化,那么它的RBM 只能通过两种可能的途径之一获得。

1) 古老的重组事件,然后是趋同进化;

2)最近发生的自然重组事件。


在第一种情况下,SARS-CoV-2 的祖先,一种类似ZC45/ZXC21 的蝙蝠冠状病毒会与一种携带相对"完整"RBM的冠状病毒(参照SARS)进行重组和"交换"。这种重组将导致一种新型的ZC45/ZXC21 样冠状病毒,其RBM 中的所有空白都被"填补"了(图4)。随后,该病毒将不得不在其新的宿主中进行广泛的适应,其中ACE2 蛋白与hACE2 高度同源。整个基因组的随机突变将不得不发生, 最终将RBM 塑造为其当前的形式——以一种高度智能的方式使其类似于SARS-CoV RBM。然而,这种趋同的进化过程也会导致基因组其他部分大量积累突变,使得整体序列同一性相对较低。SARS-CoV-2 与ZC45/ZXC21 在各种蛋白质上的高一致性(94-100%同一性)并不支持这种情况,因此,明确指出携带这种RBM 的SARS-CoV- 2 不可能通过这种趋同进化途径从类似ZC45/ZXC21 的蝙蝠冠状病毒上获得。


在第二种情况下,类似ZC45/ZXC21 的冠状病毒必须在最近与另一种成功地适应了与hACE2 高同源的动物ACE2 结合的冠状病毒进行重组和交换其RBM。这种事件的可能性部分取决于自然重组的一般要求。

(1) 两种不同的病毒在序列上有很大的相似性;

(2) 它们必须共同感染并存在于同一动物的同一细胞中;

(3) 重组病毒不会被宿主清除或使宿主灭绝;

(4) 重组病毒最终必须变得稳定并在宿主物种内传播。


关于这种近期重组的情况,动物载体不可能是蝙蝠,因为蝙蝠的ACE2 蛋白与hACE2 的同源性不够,因此其适应过程不能产生SARS-CoV-2 中看到的RBM 序列。这个动物载体也不可能是人类,因为类似ZC45/ZXC21 的冠状病毒将无法感染人类。此外,在2019 年底之前,还没有证据表明任何SARS-CoV-2 或SARS-CoV-2 样病毒在人类流通。耐人寻味的是,根据最近的一项生物信息学研究,SARS-CoV-2 自爆发开始以来就对人类有良好的适应性[1]


自然进化只剩下一种可能,即ZC45/ZXC21 样病毒和含有SARS 样RBM 的冠状病毒可能在一个中间宿主中重组,其中ACE2 蛋白与hACE2 同源。一些实验室曾报道,一些从马来西亚走私到中国的马来穿山甲携带了冠状病毒,其受体结合基序(RBD)与SARS-CoV-2几乎相同[2][3][4][5]。他们接着提出,马来穿山甲很可能是SARS-CoV-2[6][7][8][9]的中间宿主。然而,最近的独立报告已经发现这个数据的重大缺陷[10][11][12]。此外,与这些报告相反,2009 年至2019[13] 43年间,在马来西亚和沙巴州收集了十多年的马来穿山甲样本中没有检测到冠状病毒。最近的一项研究还表明,SARS-CoV-2 与报告的穿山甲冠状病毒之间的共享RBD,它与hACE2 的结合力比与穿山甲ACE2 的结合力强十倍[14] ,进一步否定了穿山甲作为可能的中间宿主。最后,一项计算研究呼应了穿山甲不可能是中间宿主的观点的同时,也表明在他们的研究中,没有一种动物ACE2 蛋白与SARS-CoV-2 刺突蛋白比hACE2 有更强的结合力[15] 。这最后一项研究几乎排除了所有的动物作为疑似中间宿主的角色[16] ,这与SARSCoV-2 从爆发开始就适应人类观察相一致[17]。这是重要的,因为这些研究结果共同表明对于SARS-CoV-2 似乎没有中间宿主的存在。这至少减少了在中间宿主中发生重组事件的可能性。


即使我们忽略上述证据,即不存在合适的宿主来进行重组,假设确实存在这样的宿主,那么自然界中发生这种重组事件的可能性仍然微乎其微。

如上所述,如果自然界的重组事件是SARS-CoV-2 出现的原因,那么类似ZC45/ZXC21 的病毒和含有类似SARS RBM(受体结合基序)的冠状病毒必须在同一细胞中通过交换S1/RBM 进行重组。这是一种罕见的重组形式。此外,由于SARS 在人类历史上只发生过一次,因此,自然界如此智能的以只在几个非必要的位点上拥有与SARS RBM 不同的RBM的方式产生一种类似SARS 的病毒。这至少也是同样罕见的(图4)。这种独特的类似SARS 的冠状病毒与类似ZC45/ZXC21 的祖先病毒驻留在同一细胞中,两种病毒以"RBM 交换"的方式进行重组的可能性极低。重要的是,这种情况以及下面1.3 节中所描述的另一种重组事件(在自然界中更不可能发生)正如在SARS-CoV-2 上所看到的都必须在其过程中产生刺突蛋白。


假设SARS-CoV-2的RBM来源于实验室的可能

虽然上述证据和分析加在一起似乎并不支持SARS-CoV-2 的受体结合基序起源于自然,大量的文献显示,功能增强研究——冠状病毒的刺突蛋白被特殊改造,已经多次成功地将非人类来源冠状病毒转变为感染人类的冠状病毒[18][19][20][21]


记录也显示,研究性实验室,例如武汉病毒研究所(WIV),已经成功地与美国研究人员合作开展了此类研究[22],以及独立的工作[23]。此外,武汉病毒研究所从事了几十年的冠状病毒监测研究,因此拥有世界上最大量的冠状病毒收藏。显然,武汉病毒研究所和其他相关实验室开展并成功地进行了刺突蛋白/受体结合基序的基因工程改造和功能增强研究,这方面的技术障碍是不存在的。


About sc2 and other virus rbm cut.png]

图5.SARS-CoV-2 的受体结合基序(RBM)两端都有两个限制性位点,为替换刺突蛋白基因内的受体结合基序提供了方便。

A.SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1)的受体结合基序的核苷酸序列。在受体结合基序的5'-端发现一个EcoRI 位点,在3'-端发现一个BstEII 位点。

B.虽然这两个限制性位点不存在于ZC45 的原始刺突蛋白基因中,但考虑到这两个位点的序列差异较小(2 个核苷酸) ,在两种情況下均可以方便地引入。

C. 氨基酸序列排布与相应的受体结合基序(已标注颜色和下划线)。橙色(顶部)突出显示的受体结合基序是由SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1)刺突蛋白中的EcoRI 和BstEII 位点定义的。品红色(中间)突出显示的受体结合基序是由李放博士及其同僚所置换成SARS 刺突蛋白的骨架区域[24]。蓝色(底部)突出显示的受体结合基序是来自SARS-BJ01(AY278488.2)的刺突蛋白(RBM:424-494),该区域被石正丽实验室团队以相应的片段置换成不同蝙蝠冠状病毒的刺突蛋白[25]



引人注目的是,与“受体结合基序工程改造”理论相一致,我们在SARS-CoV-2 基因组的受体结合基序两端分别发现了两个独特的限制性位点EcoRI 和BstEII(图5A)。这两个位点,是当下普遍分子克隆的热门选择,但这两个位点在这个刺突蛋白基因的其他部位并不存在。这种特别的设置使得在刺突蛋白基因内交换受体结合基序极为方便,为测试不同的受体结合基序和相应的刺突蛋白提供了一种快速的方法。


注:EcoRI和BstEII都是限制性内切酶,是一种从细菌上产生的酶,这种酶可以识别特定的核苷酸序列并且对特定部位进行切割,通俗的说法叫做基因剪刀,是基因编辑使用的一种技术。图5中特别标注的序列就是这两种酶能够识别的部分。


这样的EcoRI 和BstEII 位点在其他β-冠状病毒的刺突蛋白基因中并不存在,这强烈地表明它们是不自然的,是为了方便调控关键的受体结合基序而专门引入SARS-CoV-2 的这个刺突蛋白基因中的。尽管ZC45 的刺突蛋白基因也没有这两个位点(图5B),但如本报告第2 部分所述,它们可以被非常容易地引入。


注:新冠病毒就是属于β类冠状病毒


值得注意的是,引入这里的EcoRI 位点会将相应的氨基酸序列从-WNT-变为-WNS-(图5AB)。据我们所知,所有的SARS 和类似SARS 的蝙蝠冠状病毒都只在这个位置携带一个T(苏氨酸)残基。SARS-CoV-2 是唯一例外,这个T 已经突变为S(丝氨酸),还有可疑的RaTG13 和在疫情爆发后发表的“穿山甲冠状病毒”[26]


一旦限制性位点被成功地引入,受体结合基序片段可以通过常规的限制性内切酶进行酶切和连接,因此可以方便地进行置换。虽然替代性克隆技术可能不会留下任何遗传操控的痕迹(吉布森Gibson 组装就是一个例子),但选择这种老式的方法是可行的,因为它在置换关键的受体结合基序时提供了很大程度的便利。


鉴于受体结合基序完全决定hACE2(人源ACE2 受体)的结合,以及SARS RBM-hACE2 的结合已完全由高分辨率的结构得以阐释(图3)[27][28], 这个仅受体结合基序的置换不会比任何全刺突蛋白的置换的风险更大。事实上,这种受体结合基序置换策略的可行性已经被证实[29][30]。2008 年,在引入一个限制性位点到一个密码子优化后的刺突蛋白基因之后,石正丽博士的小组将SARS 受体结合基序置换到几个SARS 样蝙蝠冠状病毒的刺突蛋白中(图5C)[31]。此后,他们验证了所产生的嵌合刺突蛋白与hACE2(人源ACE2 受体)的结合。此外,在最近的发表的文献中,SARS-CoV-2 的受体结合基序被置换到SARS-CoV 的受体结合区域(RBD),导致一个嵌合RBD 全功能地与hACE2 结合(图5C)[32]。引人注目的是,在这两种情况下,被操控的受体结合基序片段几乎完全与由EcoRI 和BstEII 位点的位置所定义的受体结合基序相似(图5C)。虽然这两个文献缺乏相应的克隆细节[33][34],可想而知,实际的限制性位点可能会有所不同,这取决于刺突蛋白基因所接受的受体结合基序的插入片段,以及便于在兴趣相关区域引入独特的(一个或多个)限制性位点。值得一提的是,最近发表的这篇论文[35]的通讯作者李放博士,自2010 年[36][37][38][39][40]以来一直是石正丽博士的活跃合作者。李博士是世界上第一个从结构上阐明SARS-CoV 的受体结合基序和hACE2 之间结合的人[41],也是领衔对刺突蛋白-ACE2 相互作用的结构阐释的主要专家[42][43][44][45][46][47]。在SARS-CoV-2 受体结合基序的两端分别发现EcoRI 和BstEII 限制性位点的惊人事实,以及同一受体结合基序区域分别被石正丽博士和她的长期合作者用限制性酶切方法进行了置换的事实,这都不可能是巧合。然而,这是确凿的证据,证明了SARS-CoV-2 的受体结合基序/刺突蛋白是基因工程操控的产物。


虽然复制SARS 受体结合基序的确切序列可能很方便,但这有太过明显的人为设计和操纵的迹象。更具欺骗性的方法将是改变一些非必要的残基,而保留那些关键的结合序列。这种设计可以很好地由高分辨率结构所指示( 图3)[48][49]。这样一来,即便受体结合基序的整体序列会显得与SARS 受体结合基序的区别较大,但与hACE2的结合能力将得到很好的保留。我们认为,所有的关键残基(图4 中用红色横线标记的残基,与图3C 中横线所示的残基相同)都应该被"保留"。如前所述, 虽然有些应该是直接保留,但有些应该已经换成具有类似性质的残基,这不会破坏与hACE2 的结合,甚至可能进一步强化关联。重要的是,可能在非必要的位点上有意做了改动,使之不像将SARS 受体结合基序"复制、粘贴"。

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