利用现有技术人工合成SARS-CoV-2的可能的流程

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关联组

SARS-CoV-2是实验室产物的证据以及可能的合成流程

条件组

ZC45与ZXC21的组成蛋白与基因组全序列

SARS-CoV-2的S蛋白的弗林酶切位点的来源可能

SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合基序的来源可能

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本词条是基于闫博士报告的再编辑

解读合成SARS-CoV2 病毒的流程

在这份报告的第二部分，我们描述一下在实验室环境下制造SARS-CoV-2 的合成路线。这个假设是基于大量文献支持以及SARS-CoV-2 里留下的基因证据的。当然这里的步骤或许并不完全是他们制造病毒的真实步骤，但我们相信核心流程不会差别很大。重要的是，我们的工作只是示范，在运用已证实的概念和成熟的技术上，如何在实验室里方便地设计和创造SARS-CoV-2。

重要的是，无论是从资源配备还是研究成果上，香港和中国大陆的研究实验室都是世界顶级冠状病毒实验室。后者不只是说过去20 年他们发表的大量文章，也是因为他们在这个领域一些划时代的研究成果。比如：他们第一个鉴定果子狸是SARS-CoV 的中间宿主，并分离得到了第一株病毒毒株。他们也是最早揭示冠状病毒来自蝙蝠的。他们也首次在世界上揭示了SARS-CoV1 感染后造成的抗体依赖性增强（ADE）。他们的研究也极大推进了对中东呼吸综合征病毒的理解，同样他们也在SARA-CoV-2 上的研究获得了好几项突破。最后一点，但也很重要的，他们拥有世界上最大的、搜集了各种冠状病毒的病毒库（基因组序列和活病毒）。这所有的知识、技术、资源在大陆和香港的实验室（他们有着广泛的合作）都是触手可及的，都可以随时帮助他们实现以下的工作。


SARS-CoV-2可能的合成路径图.png

图8.实验室制造SARS-CoV-2 可能使用的合成路径图


实验室创造新型冠状病毒的可能设计方案。

在本小节中，我们概述了在项目设计阶段可能制定的总体战略和主要考虑因素。

为了设计和创造一个以人类為目标的冠状病毒，他们不得不选择一种蝙蝠冠状病毒，作为模板/骨架。这可以很方便地完成，是因为许多研究实验室在过去二十年里，一直积极的收集蝙蝠冠状病毒[1][2][3][4][5][6][7][8][9]。所以这个模板病毒，应该不是石正丽博士所收藏的，考虑到她一直从事冠状病毒的功能研究，而这也是众所皆知的。因此，ZC45 和/或ZXC21，这些由军方实验室发现并拥有的新型蝙蝠冠状病毒[10]，适合作为模板和/或骨架。而且有可能这些军方实验室还从同一病毒发现了其他密切相关的病毒，但并未公布。因此，实际的模板可能是ZC45 或ZXC21 或它们的近亲。无论三者中哪一个是事实上的模板，下面描述的假设途径都是一样的。

一旦选择模板病毒，他们首先需要通过分子克隆对刺突蛋白进行改造，使其能够与hACE2 结合。这个概念和克隆技术所涉及的操作，已经在文献[11][12][13][14][15]充分证明。所以将模板蝙蝠病毒转换为可以与hACE2 结合并感染人类的冠状病毒[16][17][18]，这几乎没有失败的风险。


其次，他们使用分子克隆在刺突的S1/S2 连接处引入弗林酶切位点。基于已知的知识[19][20][21]，这种操作很可能会产生一种更具传染性和致病性的冠状病毒株。


第三，他们将产生一个ORF1b 基因构建体。ORF1b 基因对Orf1b 长肽链进行编码，使其转化加工产生单个病毒蛋白。RNA 依赖性RNA 聚合酶(RdRp)、解旋酶，胍基-N7 甲基转移酶，花生四烯酸特异性内切核糖核酸酶和2’-O-甲基转移酶。所有这些蛋白都是病毒复制机制的一部分。其中，RdRp 蛋白是最关键的一个，在冠状病毒中是高度保守的。重要的是，石正丽博士的实验室采用聚合酶链式反应PCR 技术，将RdRp 基因的特定片段进行扩增作为他们检测原始样本（蝙蝠粪便交换、粪便等）中是否存在冠状病毒的主要方法。这种实践的结果，石正丽团队记录了他们成功检测和/或收集到的所有冠状病毒的RdRp 的这个短片段的序列信息。

在这里，基因操纵的要求较低或是说不复杂，因为Orf1b 是保守的，任何β 类冠状病毒的Orf1b 都可能足以胜任这项工作。但是，我们认为，他们会希望将特定的Orf1b 引入病毒中的两种可能原因之一是：

1.由于许多系统进化分析仅根据RdRp 基因的序列相似性对冠状病毒来进行分类[22][23][24][25][26]，因此，在基因组中具有不同的RdRp，可以确保SARS-CoV-2 和ZC45/ZXC21 在系统发育研究中，被分成不同的组/亚系。然而，选择RdRp 基因是很方便的，因为RdRp 短段序列已经被记录在所有收集/检测到的冠状病毒中。他们最终选择的是2013 年发现的蝙蝠冠状病毒RaBtCoV/4991 的RdRp 序列。对于RaBtCoV/4991，曾经公布的唯一信息是其短RdRp 段的序列[27]，而其全基因组序列和病毒分离都没有被报道过。在扩增了RaBatCoV/4991 的RdRp 片段（或整个ORF1b 基因）后，他们就会将其用于SARS-CoV-2 基因组的后续组装和创建。RdRp 序列的微小变化可以在开始时引入(通过DNA 合成)，也可以在以后通过细胞传代生成。另一方面，当他们构建RaTG13 序列时，他们可能从RaBtCoV/4991 的RdRp 短段开始，而没有对其序列进行任何修改，导致这两种病毒在RdRp 短段上的核苷酸序列100%相同[28]。这个RaTG13 病毒就可以宣称早在2013 年就被发现了。

2.RaBatCoV/4991 的RdRp 蛋白的独一无二之处在于它比其他任何β 类冠状病毒的RdRp 都有利于开发抗病毒药物。RdRp 在人体细胞中没有同源物，这使得这种至关重要的病毒酶成为抗病毒开发的非常理想的靶点。以目前正在进行临床试验的瑞德西韦药为例，其靶点就是RdRp。在创造一种新型的、针对人类的病毒时，他们也会对开发其解药感兴趣。即使这样的药物开发不容易实现，但他们也有意加入更适合抗病毒药物开发的RdRp，这看上去似乎也是合理的。


第四，他们将利用反向遗传学将穗基因片段、ORF1b 和模板ZC45 的其余部分组装成病毒基因组的cDNA 版本。然后他们会进行体外转录以得到病毒RNA 基因组。通过将RNA 基因组转染到细胞，就可以回收具有所需人工基因组的活病毒和传染性病毒。


第五，他们将对病毒菌株进行特征分析和优化，以提高其人体适应性、感染力和整体适应性，最后获得符合一定标准的一个或几个的病毒株作为终产品。


创造SARS-CoV-2 的假定合成途径

在本小节中，我们将更详细地描述如何在实验室环境中利用现有材料和常规的分子、细胞和病毒学技术进行病毒制备的每个步骤。这个过程的示意图如图8 所示。我们估计，整个过程可以在大约6 个月内完成。

步骤1：改造刺突蛋白上的RBM 适应与hACE2 结合（1.5 个月）。

蝙蝠冠状病毒的刺突蛋白由于其RBM 内重要残基的缺失而不能或不能有效与hACE2 结合。这可以通过模板病毒ZC45 的RBM（图4）为例。在SARS-CoV-2 的创造中，第一个也是最关键的步骤是对刺突进行基因改造，使其获得结合hACE2 的能力。正如文献中所证明的那样，自2008 年[29]以来，多家科研实验室已经反复进行了这种操作，成功地产生了具有感染人体细胞能力的被改造的冠状病毒[30][31][32][33][34]。虽然制造这种刺突蛋白有许多可能的方法，我们相信，实际操作中他们应当是参照SARS 的RBM，进行设计并优化得到新的RBM，并用新的RBM 替换原始RBM。如第1 部分所述，以下观察可以支持我们这一观点：SARS-CoV-2 基因组的RBM 两端存在两个独特的限制性酶切位点EcoRI 和BstEII（图5A），而且石正丽博士和她的长期合作者结构生物学专家李放博士已经成功实施了RBM 置换操作[35][36]。


虽然ZC45 的刺突蛋白不包含这两个限制性酶切位点(图5B)，但引入它们是非常容易的。原始的刺突基因可用RT-PCR 扩增或通过DNA 合成（在序列的某些可变区安全地引进一些变化），再通过PCR 获得。然后利用EcoRI 和BstEII 以外的限制性酶切位点将该基因克隆到质粒中。


一旦进入质粒中，穗基因可以很容易地被修改。首先，可以通过将突出显示的"gaacac"序列（图5B）转换为所需的"gaattc"来引入一个EcoRI 位点。（图5A）。它们之间的区别是两个连续的核苷酸。使用市售的QuikChange 位点定向诱变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis kit)，这样的双核苷酸突变可以在不超过一周的时间内产生。随后，BstEII 位点可以类似地被引入到RBM 的另一端。具体来说，"gaatacc"序列(图5B)将被转换为所需的"ggttacc"(图5A)，这同样需要一周的时间。


一旦成功引入了SARS-CoV-2 的穗基因中独特的这些限制性酶切位点，不同的RBM 段就可以方便地被交换，随后就可以用既定的检测方法对所产生的刺突蛋白进行评估。


如第1 部分所述，RBM 段的设计可以由高分辨率结构（图3）[37][38]很好地引导，从而以智能的方式产生一个类似SARS RBM 的序列。在进行结构指导下的RBM 设计时，他们会遵循常规程序，并产生一些（ 例如十几个）这样的RBM， 希望在结合hACE2 方面， 某些特定变体可能会优于其他变体。一旦设计完成，他们可以让每个设计好的RBM 基因商业化合成（快速且价格合理），在5'-端有一个EcoRI 位点，在3'-端有一个BstEII 位点。然后，这些新型RBM 基因可以分别克隆到穗基因中。基因合成和随后的克隆，由设计好的RBM 小库以批处理方式完成，这个过程大概需要一个月的时间。


可采用已有的假病毒感染检测方法[39][40][41]来测试这些改造后的刺突蛋白与hACE2 的结合，然后选取具有良好的甚至有特殊结合力的改造后的刺突蛋白。[尽管不是必需的，但这里可能涉及定向进化。（RBM 基因上的易错PCR），再加上体外结合试验[42][43]或假病毒感染实验[44][45][46]，以获得一个具有非凡亲和力、能与hACE2 结合的RBM。]


鉴于有关刺突改造[47][48][49][50][51]的大量文献，和刺突-hACE2 复合物[52][53]的可用高分辨率结构，这一步的成功是有很大保证的。在此步骤的最后，将获得一个符合设计的新型的穗基因，该基因能编码出一种能够以高亲和力结合hACE2 的新型刺突蛋白。


步骤2：在S1/S2 交汇处设计一个弗林酶切位点(半个月)

来自步骤1 的产品，含有改造后的刺突蛋白的质粒，在S1/S2 交界处将被进一步修改，包括弗林蛋白酶切位点（在图4 中由绿线表示的段）。可以使用几种常规克隆技术方便地插入这种短序列的基因序列，包括QuikChange 定点PCR60，重叠PCR，然后由限制性内切酶消化和连接[54]，或Gibson 重组。这些技术不会在序列中留下任何痕迹。无论选择哪种克隆方法，插入的基因片段都将包括在引物中， 引物将被设计、合成并用于克隆。这一步骤，导致进一步修改刺突，在S1/S2 交界处添加了弗林蛋白酶切位点，可以在不超过两周的时间内完成。


步骤3：从RaBtCoV/4991 获得含有RdRp 短段序列的ORF1b 基因（1 个月，但可与步骤1 和2 同时进行）。

与刺突的改造不同，这里不需要复杂的设计，除了需要包括来自RaBtCoV/4991 的RdRp 基因片段。这里可以使用Gibson 拼接技术。此技术将几个片段，每个相邻的片段共享20-40 bp 的重叠，在一个简单的反应中组合在一起，以组合成一个长的DNA 产物。将会根据已知的蝙蝠冠状病毒序列选择两个或三个片段，每一个片段都是覆盖ORF1b 基因的重要部分。其中一个片段将是RaBtCoV/499183 的RdRp 片段。每个片段将在引物中引入的适当的重叠区域进行PCR 扩增。最后，所有纯净化的片段将以等摩尔浓度汇集，并加入到Gibson 反应混合物中，经过短暂的孵育化，将产生所需要的ORF1b 完整基因整体


步骤4：利用反向遗传学制作设计的病毒基因组，并回收活病毒（半个月）。

反向遗传学经常被用于组装合并整个病毒基因组，包括冠状病毒基因组[55][56][57][58][59][60]。最近的例子是利用酵母中的转化辅助重组来重建SARS-CoV-2 基因组[61]。利用这种方法，瑞士小组组装合并了整个病毒基因组，并在短短一周内产生了活病毒[62]。自2017 年[63][64]这种高效的技术问世以来，不会在制造的病毒基因组中留下任何人工操纵的痕迹。除了经改造的穗基因（来自步骤1 和2）和ORF1b 基因（来自步骤3）之外，覆盖基因组其余部分的其他片段将通过从模板病毒的RT-PCR 扩增或通过遵循从模板病毒的序列略微改变的DNA 合成获得。我们认为，后一种方法更具可能性，因为它可以将序列变化引入到保守性较低的蛋白质的可变区域，其过程可以很容易地通过多序列比对进行引导。更具保守性功能的氨基酸序列，如E 蛋白的氨基酸序列，可能会被保持不变。然后，所有的DNA 片段将被汇集在一起，并转化到酵母中，在该酵母中SARS-CoV-2 基因组的cDNA 版本将通过转化辅助重组并进行重新组合。当然，也可以采用另一种WIV 在过去已经成功地使用了的反向遗传学的方法[65][66][67][68][69][70][71]。虽然一些早期的反向遗传学方法可能会在不同片段连接的地方留下限制性位点限制性酶切位点，但由于连接的确切位置可以在约30kb 基因组的任何地方，因此很难检测到这些痕迹。无论哪种方式，病毒基因组的cDNA 版本都可以从反向遗传学实验中获得。随后，以该cDNA 为模板进行体外转录，将产生病毒RNA 基因组，转染到VeroE6 细胞中后，可以生产具有所有设计特性的活病毒。


步骤5：优化病毒的适应性，提高病毒在人体内的hACE2 结合亲和力(2.5-3 个月)

从第4 步中回收的病毒需要经过经典的实验-实验室动物的连续传代[72]，才能进一步的适应。这最后一步将验证病毒的适应性，并确保其面向目标宿主的适应性，根据上述分析，宿主应该为人类。重要的是，RBM 和弗林蛋白酶切位点，被分别引入到刺突蛋白中，将被作为一个功能单元一起被优化。在各种可用的冠状病毒的动物模型(如小鼠、仓鼠、雪貂和猴子)中，hACE2 转基因小鼠(hACE2-小鼠)应该是最合适、最方便的选择。这种动物模型已经建立在SARS-CoV 的研究过程中，并已在Jackson 实验室使用多年[73][74][75]。


连续传代的过程很简单。简而言之，从步骤4 中选择的病毒株，即SARS-CoV-2 的前体，通过鼻腔接种到一组麻醉的hACE2 小鼠体内。感染后2-3 天左右，肺部的病毒通常会增强到一个峰值的最高滴度。然后杀死小鼠，对肺部进行均质化处理。通常，携带最高病毒载量的小鼠肺部的上清液，将用来提取候选病毒用于下一轮的传代。经过大约10~15 轮的传代后，病毒株的hACE2 结合亲和力、感染效率和致死率都会得到充分的提高，病毒基因组趋于稳定[76]。最后， 经过一系列的表征实验(如病毒动力学实验、抗体反应实验、症状观察和病理检查)，将获得最终病毒SARS-CoV-2，整个创造过程结束。从此，这种病毒病原体可以被扩增(很可能使用Vero E6 细胞)，并可进行常规生产。


值得注意的是，根据对SARS-CoV 的研究，hACE2 小鼠虽然适合SARS-CoV-2 的适应性，但并不是反映病毒在人类中的传播性和相关临床症状的好模型。我们认为，在COVID-19 爆发前，那些科学家可能没有使用合适的动物模型（如叙利亚金仓鼠）来测试SARS-CoV-2 的传播性。如果他们使用适当的动物模型进行了实验，SARSCoV-2 的高传染性就会非常明显，因此SARS-CoV-2 也不会在爆发之初被描述为"不会造成人与人之间的传播"。


我们还推测，以增强传播性和致死性为导向的广泛的实验室适应性可能已经将病毒推进得更离谱。因此，SARS-CoV-2 可能在目前对人类的适应过程中，已经失去了在传播性和致死性方面减弱的能力。这一假设与SARS-CoV-2 在大流行中，到目前为止未见明显衰减的观察一致，最近出现了主要变种出现变异后传染性增强[77][78][79][80]。


连续传代是一个快速而密集的过程，在这个过程中，病毒的适应性被加速。虽然意在模仿自然进化，但连续传代在时间和规模上都受到更多的限制。因此，与自然进化相比，连续传代过程中随机突变的情况会更少。对于保守的病毒蛋白，如E 蛋白，情况尤其如此。E 蛋白在病毒复制中至关重要，它是毒力的决定因素，对它进行改造可能会使SARS-CoV-2 毒性减弱[81][82][83]。因此，在最初的组装阶段，这些科学家可能已经决定来自ZC45/ZXC21 的E 蛋白的氨基酸序列保持不变。由于E 蛋白的保守性和连续传代的限制，实际上并没有发生氨基酸突变，导致SARS-CoV-2 和ZC45/ZXC21 之间E 蛋白的100%的序列同一性。同样的情况也可能发生在分子克隆的标记（RBM 两侧的限制性酶切位点）上。连续传代应该可以使SARS-CoV-2 基因组变得有一部分像自然进化，但不可能消除所有人工操纵的痕迹。

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