与SARS-CoV-2相关的穿山甲冠状病毒的发表过程中的疑点

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经过分析判断,一系列提示穿山甲是SARS-CoV-2中间宿主的冠状病毒均为伪造

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本词条是基于闫博士报告的再编辑

所有研究均采用了同一批次的穿山甲样本,被存储的序列数据显示出严重的样本污染和造假迹象

2019年10月,由两家机构(广东省生物资源应用研究所和广州动物园)的3名研究人员组成的团队首次报道了在据称于2019[1]年3月从马来西亚走私,并在广东省没收的穿山甲中检测到了冠状病毒感染。21个穿山甲样本进行了测序,其中5个样本的冠状病毒感染呈阳性(图2:第2、7、8、9和11号肺),也检测出了有仙台病毒感染。但在最后3个月的时间里,冠状病毒的序列和原始的测序数据都没有对外公布。在COVID-19爆发开始后,原始数据(NCBI BioProject PRJNA57329)终于在2020年1月22日公布,而文章投稿日期为2019年9月30日,发表日期为2019年10月24日[2]


在2020年3月至5月期间,四项看似独立的研究被发表了,所有这些研究都报道了新型穿山甲冠状病毒及其的组成基因组序列[3][4][5][6]。然而,经过仔细研究,我们发现这四项研究中的病毒序列都是从2019年10月发表的出版物中同一组穿山甲样本中获取的[7],这已被最近的一篇文章所证实[8]


在一项研究中[9],Liu等人(2019年10月出版物的同一组作者[10])通过汇集2019年原始研究中的两个样本和2019年7月从另一只马来穿山甲中获得的样本,重新组装了穿山甲冠状病毒的基因组。然而,尽管作者表示,较新的原始测序数据已经存入NCBI数据库[11],但我们无法使用他们提供的编录号(2312773)找到这些数据。其他人也报告了同样的问题[12]。因此,2019年7月的数据集是否真正存在,并是否为报告的基因组组装做出了贡献无法被验证。


在另外两项研究中,Lam等人[13]和Zhang等人[14]分别只使用2019年10月研究[15]中公布的数据集重新组装了一种穿山甲冠状病毒的基因组。Lam等人还报道了从广西省没收的走私马来穿山甲中检测到了冠状病毒[16],尽管这些病毒在全基因组水平(约86%相同)和关键受体结合域(RBD)都显示出与SARS-CoV-2较低的序列相同性。值得注意的是,这项研究是由香港大学管轶博士小组和中国北京军事医学科学院曹务春博士小组合作完成的[17]不知何故,尽管所有隶属于军事医学科学院的作者在出版物的最终版本中都有署名[18]但文章首次提交时,他们都被排除在作者名单之外[19]


在第四项研究中,Xiao等人宣称检查了从感染的穿山甲身上保存的细胞组织样本,并获得了后续组装的原始测序数据[20]。然而,他们并没有说明样本是如何获得的。在他们的扩展数据表3中,他们列出了研究中使用的宏基因组测序数据[21],令人惊讶的是,这与他们在数据库中上传的实际数据并不一致(图2)。在他们存入的数据中可以找到样本M1、M5、M6、M10和Z1,但却找不到M2、M3、M4和M8。此外,Xiao等人对这些原始测序片段的报告显然是不一致的。对于样本M1、M6、穿山甲3和穿山甲5,他们计算了双端测序数,这反映了库中测序DNA片段的实际数量。对于其余的样本,作者则用测序片段数代替(在Illumina测序中,每个DNA片段有两个测序片段)。对于后一组[22]中的样本M2、M3、M4和M8,当测序片段数转换为双端测序数(除以2)时,它们分别与2019年10月研究中的肺07、肺02、肺08和肺11完全匹配(图2)[23]。显然,Xiao等人使用了之前的研究中发表的数据,但并没有在他们的出版物中披露这一必要信息[24]。实际上,他们还故意用不同的形式呈现"测序片段数",使读者忽略他们使用了相同测序数据集的事实。


值得注意的是,Xiao等人的研究也是与军事医学科学院(AMMS)合作完成的。在手稿发表之前,这项研究是在一次新闻发布会上首次公开的[25][26]。在这次发布会中透露,有四位主要研究者对这项研究做出了贡献,其中一位就是来自军事医学科学院的杨瑞馥博士。然而,就像曹博士和他的军事医学科学院同事在Lam等人研究中的遭遇一样[27],杨博士的名字也被从Xiao等人的研究手稿中排除[28]。然而,与其他研究不同的是,军事医学科学院研究人员的名字并没有再次出现在最终的出版物中[29]。另外值得注意的是,这两位军事医学科学院的主要研究者杨博士和曹博士一直是长期合作者,他们的合作工作大多涉及SARS-CoV的基因分析[30][31][32][33]


在这四项研究中,只有两项研究通过使用聚合酶连锁反应(PCR)[34][35]进行缺口填充,组装了完整的基因组。然而,这两个小组都没有提供他们的缺口填充序列[36],使独立的验证不可能进行。值得注意的是,在RaTG13的报告中也发生了在公布基因组序列后很久才公布原始测序片段的延迟情况。


除上述问题外,近期报道显示,原始测序数据的质量也很差[37][38][39]测序片段的组成。通过对NCBI SRA数据库(存储二代测序的原始数据)进行分类分析,我们还发现,在Liu等人的研究中,冠状病毒呈阳性的样本在进行人类基因组的测序时也都呈阳性。与此形成巨大反差的是,其余病毒测序为阴性的样本也没有检测到人类测序。在Xiao等人[40]提出的数据中也发现了同样的相关性。虽然样本M5(穿山甲6)和M6(穿山甲2)的人类测序结果为阴性,但这两个样本的病毒测序片段很少,很难对病毒基因组的组装做出贡献。显然,人为污染不是由于样品处理造成的,因为冠状病毒呈阴性的样品也经过类似的处理,但它们都没有这种污染。此外,病毒测序和人类测序的一致共存也非常可疑。


Liu与Xiao等人保存的原始测序数据分.png 表2. Liu与Xiao等人保存的原始数据测试分


这些观察不仅在组装序列的可信度上而且在新型穿山甲冠状病毒的真实性上都发出了红色警报。还值得注意的是,所有四项研究的论文投稿日期都在2月7日至2月18日之间[41][42][43][44],这表明它们的发表可能是被故意安排的。

  1. Liu, P., Chen, W. & Chen, J.P. Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica). Viruses 11, doi: 10.3390/v11110979 (2019).
  2. Liu, P., Chen, W. & Chen, J.P. Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica). Viruses 11, doi: 10.3390/v11110979 (2019).
  3. Lam, T.T. et al. Identifying SARS-CoV-2-related coronaviruses in Malayan pangolins. Nature (2020).
  4. Liu, P. et al. Are pangolins the intermediate host of the 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2)? PLoS Pathog 16, e1008421 (2020).
  5. Xiao, K. et al. Isolation of SARS-CoV-2-related coronavirus from Malayan pangolins. Nature (2020).
  6. Zhang, T., Wu, Q. & Zhang, Z. Probable Pangolin Origin of SARS-CoV-2 Associated with the COVID-19 Outbreak. Curr Biol 30, 1578 (2020).
  7. Liu, P., Chen, W. & Chen, J.P. Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica). Viruses 11, doi: 10.3390/v11110979 (2019).
  8. Chan, Y.A. & Zhan, S.H. Single source of pangolin CoVs with a near identical Spike RBD to SARS-CoV-2. bioRxiv, https://doi.org/10.1101/2020.07.07.184374 (2020).
  9. Liu, P. et al. Are pangolins the intermediate host of the 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2)? PLoS Pathog 16, e1008421 (2020).
  10. Liu, P., Chen, W. & Chen, J.P. Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica). Viruses 11, doi: 10.3390/v11110979 (2019).
  11. Liu, P. et al. Are pangolins the intermediate host of the 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2)? PLoS Pathog 16, e1008421 (2020).
  12. Chan, Y.A. & Zhan, S.H. Single source of pangolin CoVs with a near identical Spike RBD to SARS-CoV-2. bioRxiv, https://doi.org/10.1101/2020.07.07.184374 (2020).
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  15. Liu, P., Chen, W. & Chen, J.P. Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica). Viruses 11, doi: 10.3390/v11110979 (2019).
  16. Lam, T.T. et al. Identifying SARS-CoV-2-related coronaviruses in Malayan pangolins. Nature (2020).
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